你辛苦筛选出来的单克隆抗体，终于看到了阳性克隆。但有一个问题你可能还没回答：它是什么类型的抗体？是IgG还是IgM？如果是IgG，是IgG1、IgG2a、IgG2b还是IgG3？ 这个“身份信息”不仅决定了抗体的下游应用（如Protein A/G纯化、补体激活能力），更是论文发表和专利申报的必备数据。今天我们就来拆解小鼠单抗的Ig类/亚类鉴定——这个看似简单却至关重要的实验。
一、什么是Ig类/亚类鉴定？
小鼠的免疫球蛋白（Ig）分为多种类别和亚类，分别由不同的重链基因编码：
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类别/亚类
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重链类型
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主要特征
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IgM
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μ链
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初次免疫应答，五聚体结构
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IgG1
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γ1链
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最常用，Th2型免疫应答
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IgG2a
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γ2a链
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Th1型免疫应答，强补体激活
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IgG2b
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γ2b链
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介于两者之间
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IgG3
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γ3链
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较少见，铰链区较长
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IgA
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α链
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黏膜免疫
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IgE
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ε链
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过敏反应
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此外，还有轻链类型（κ或λ），但单抗鉴定中最优先确定的是重链的类别/亚类。
为什么需要鉴定？
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原因
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说明
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纯化方法选择
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不同亚类与Protein A/G的结合能力不同
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功能预期
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IgG2a比IgG1有更强的补体激活和ADCC效应
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下游应用设计
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二抗选择、检测系统优化
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质量控制
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确认杂交瘤分泌的是单克隆抗体
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文献/专利要求
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必需的基础数据
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二、小鼠IgG各亚类的关键差异
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特征
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IgG1
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IgG2a
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IgG2b
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IgG3
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与Protein A结合
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弱
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强
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强
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强
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与Protein G结合
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强
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强
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强
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强
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补体激活能力
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弱
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强
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中等
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强
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ADCC效应
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弱
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强
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中等
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中等
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铰链区长度
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短
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短
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中等
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长
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Th偏向性
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Th2
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Th1
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Th1/Th2混合
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少见
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这些差异意味着什么？
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应用场景
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推荐亚类
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理由
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治疗性抗体（需要ADCC）
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IgG2a
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更强的效应功能
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中和抗体（阻断受体）
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IgG1 或 IgG2a
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两者均可
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免疫组化（低背景）
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IgG1（γ链特异性二抗成熟）
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背景控制好
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流式细胞术
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均可
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需匹配二抗
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Protein A纯化
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避免IgG1
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结合弱，需用Protein G
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如果不鉴定亚类，直接用Protein A纯化IgG1——你可能什么都纯化不出来。
三、鉴定方法：ELISA法是最佳选择
基本原理
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步骤
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操作
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目的
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1
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包被抗小鼠Ig（通用）
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捕获待测单抗
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2
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加入待测单抗（杂交瘤上清）
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让抗体被捕获
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3
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加入亚类特异性二抗（抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、κ、λ）
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识别不同亚类
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4
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加入酶标二抗（如HRP-抗亚类二抗）
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信号放大
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5
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显色、读数
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判断阳性孔
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结果判读：
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孔
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亚类特异性二抗
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信号
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结论
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A
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抗IgG1
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强阳性
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IgG1型
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B
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抗IgG2a
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阴性
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—
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C
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抗IgG2b
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阴性
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—
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D
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抗IgG3
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阴性
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—
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E
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抗IgM
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阴性
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—
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该单抗为小鼠IgG1型，κ或λ轻链需进一步确认。
四、注意事项与常见问题
1. 捕获抗体的选择
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捕获方式
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优点
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缺点
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抗小鼠κ/λ轻链
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捕获所有Ig（不分亚类）
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轻链通用性好
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抗小鼠IgG（H+L）
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捕获所有IgG
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会漏检IgM/IgA/IgE
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抗小鼠Fc
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亚类捕获可能有偏差
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不同亚类结合效率不同
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推荐使用抗小鼠κ/λ轻链作为捕获抗体，确保所有Ig类别的单抗都被捕获。
2. 二抗的特异性
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问题
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后果
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解决方案
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二抗交叉反应
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多个孔同时阳性
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换用高特异性亚类二抗
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二抗浓度过高
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背景升高
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滴定优化
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二抗浓度过低
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假阴性
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按推荐稀释度使用
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3. 阳性对照
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对照
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用途
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已知亚类的单抗
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验证各亚类二抗的工作状态
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空白对照（无一抗）
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检测背景水平
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阴性对照（无关单抗）
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确认无交叉反应
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五、结果解读指南
正常结果模式
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结果模式
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结论
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仅一个亚类孔阳性
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✅ 单克隆，亚类已确定
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两个或以上亚类孔阳性
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⚠️ 可能是：①二抗交叉反应 ②多克隆混合物 ③杂交瘤不纯
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所有孔均为阴性
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❌ 可能是：①上清中无抗体 ②捕获抗体失效 ③二抗失效
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轻链孔阳性（κ或λ）
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确定轻链类型
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异常结果的排查
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异常
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可能原因
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排查方法
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多孔阳性
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二抗交叉反应
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换用预吸附二抗
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所有孔弱阳性
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上清中抗体浓度低
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浓缩上清或换用更灵敏的检测系统
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背景高
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封闭不充分
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延长封闭时间或换封闭剂
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六、亚类鉴定的时间点
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阶段
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是否建议做
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理由
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杂交瘤筛选后（扩增前）
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⚠️ 可选
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上清中抗体浓度低，可能有假阴性
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亚克隆后（稳定克隆）
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✅ 强烈建议
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确认单克隆性
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腹水制备后
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✅ 推荐
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腹水中抗体浓度高，鉴定更准确
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纯化后
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✅ 推荐
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最终确认产品亚类
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建议在稳定亚克隆后进行首次鉴定，纯化后再次确认。
七、不同亚类的下游应用建议
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亚类
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纯化建议
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二抗选择
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功能特点
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IgG1
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Protein G（不能用Protein A）
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抗小鼠IgG1（链特异性）
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ADCC弱，中和活性好
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IgG2a
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Protein A或G
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抗小鼠IgG2a
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ADCC强，补体激活强
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IgG2b
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Protein A或G
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抗小鼠IgG2b
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介于两者之间
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IgG3
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Protein G
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抗小鼠IgG3
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铰链区长，补体激活强
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IgM
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不适用亲和纯化
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抗小鼠IgM（μ链特异性）
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五聚体，强补体激活
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八、总结
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核心问题
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答案
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什么是Ig类/亚类鉴定？
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确定单克隆抗体的重链类别（IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM等）
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为什么要做？
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①决定纯化方法 ②预判功能特性 ③下游实验设计 ④文献/专利要求
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IgG1和IgG2a有什么不同？
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IgG2a补体激活和ADCC更强；IgG1更常见于Th2型应答
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鉴定方法是什么？
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ELISA法：捕获抗体+亚类特异性二抗
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能直接上Protein A纯化吗？
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不能——IgG1与Protein A结合很弱，可能纯化失败
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什么时候做最合适？
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亚克隆稳定后做首次鉴定，纯化后再次确认
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最容易被忽略的点？
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IgG1不能用Protein A纯化——这是新手最常犯的错误
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给单抗做一次“身份证鉴定”，不只是为了填一份数据表格，而是为了知道：它能做什么、不能做什么、怎么用它才最好。
