猪轮状病毒VP6与VP7蛋白真核表达系统的构建及其免疫原性分析

猪轮状病毒是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一，对全球养猪业构成严重威胁。该病毒的VP6和VP7蛋白作为重要的结构蛋白，在病毒组装和免疫应答中发挥关键作用。VP6蛋白形成病毒内衣壳，具有群特异性抗原决定簇；VP7蛋白则为外衣壳糖蛋白，参与中和抗体的诱导。目前，针对猪轮状病毒的疫苗研发仍面临挑战，传统灭活疫苗或减毒活疫苗存在免疫效果有限、安全性等问题。利用真核表达系统制备病毒蛋白亚单位疫苗，能够有效规避完整病毒的使用，同时保留良好的免疫原性。因此，构建VP6与VP7蛋白的真核表达系统，并评估其免疫学特性，对于开发新型轮状病毒疫苗具有重要意义。

在真核表达系统的构建过程中，首先通过RT-PCR技术从猪轮状病毒阳性样本中扩增VP6和VP7基因片段。经测序验证后，将目的基因分别克隆至真核表达载体，构建重组质粒。为提高蛋白表达效率，选用经过优化的哺乳动物细胞密码子，并在载体中引入增强型启动子与筛选标记。重组质粒转染人胚胎肾细胞后，通过Western blot与间接免疫荧光实验验证蛋白表达。结果显示，VP6与VP7蛋白在转染细胞中均获得成功表达，且具备正确的分子量与抗原特异性。

为分析表达蛋白的免疫学特性，将纯化的VP6与VP7蛋白分别免疫小鼠，并设立空载体对照组。初次免疫后第0、14及28天采集血清样本，采用间接ELISA法检测特异性抗体水平。实验结果表明，免疫组小鼠血清中针对VP6与VP7的特异性IgG抗体效价显著高于对照组，且在加强免疫后呈现持续上升趋势。此外，通过病毒中和试验评估免疫血清对猪轮状病毒的中和能力。结果显示，VP7免疫组血清表现出较强的病毒中和活性，而VP6免疫组亦显示一定的交叉保护能力。

在细胞免疫应答方面，通过流式细胞术检测免疫小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ与IL-4的表达水平。VP6与VP7蛋白均能诱导特异性T淋巴细胞增殖，并促进Th1型细胞因子IFN-γ的分泌，表明其可激发细胞免疫应答。比较两种蛋白的免疫效果发现，VP7在诱导中和抗体方面