鼠抗鱼小清蛋白单克隆抗体的制备与应用研究

小清蛋白作为一种重要的钙结合蛋白，广泛存在于鱼类肌肉组织中，不仅是引起鱼类过敏的主要过敏原，也是鱼类物种鉴定的重要分子标志物。因此，制备高特异性、高灵敏度的鼠抗鱼小清蛋白单克隆抗体，对于食品安全检测、过敏原诊断以及基础生物学研究均具有关键意义。多克隆抗体因其固有的批次间差异性和交叉反应性，在精准检测应用中存在局限。而单克隆抗体技术则能提供性质均一、可无限量生产的特异性识别工具，有效克服上述不足。本研究聚焦于该特异性单克隆抗体的制备流程及其在多领域的应用潜力，旨在为相关科研与产业实践提供可靠的技术支持。

在单克隆抗体的制备过程中，抗原的纯化与动物免疫是首要且关键的步骤。通常采用硫酸铵沉淀、离子交换层析或凝胶过滤层析等方法，从鱼类肌肉组织中分离并纯化出高纯度的小清蛋白。将纯化后的小清蛋白与弗氏佐剂充分乳化，通过皮下或腹腔注射途径免疫BALB/c小鼠。经过数次免疫后，需定期采集小鼠血清，采用酶联免疫吸附测定法监测抗体效价的动态变化。当抗体效价达到平台期时，在细胞融合前三天对小鼠进行加强免疫，此举旨在最大化激活脾脏内B淋巴细胞的增殖与分化，为后续成功的细胞融合奠定坚实基础。

细胞融合与杂交瘤筛选是单克隆抗体制备的核心环节。取高效价免疫小鼠的脾细胞，与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞在聚乙二醇作用下进行诱导融合。融合后的细胞转移至含有HAT选择性培养基的96孔板中进行培养。在此体系中，未融合的脾细胞因无法长期存活而自然淘汰，未融合的骨髓瘤细胞则因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶而被HAT培养基阻断DNA合成途径导致死亡，唯有成功融合的杂交瘤细胞能够存活并增殖。随后，运用间接ELISA法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选，初步鉴定出能分泌目标抗体的阳性孔。

对初步筛选出的阳性杂交瘤细胞株，进行有限稀释法亚克隆是确保单克隆性的必要步骤。通过将细胞稀释至每孔约0.5至1个细胞的浓度进行培养，可最终获得由单个细胞增殖形成的细胞克隆。此过程通常需重复进行两